產(chǎn)品及特點(diǎn)：
蛙病毒(Ranavirus)可以在較廣泛的培養(yǎng)細(xì)胞上生長(zhǎng)，并對(duì)感染細(xì)胞具有抑制其大分子生物合成的作用。蛙病毒在細(xì)胞漿中的增殖與痘病毒相似，但該病毒的核酸合成既依賴于宿主細(xì)胞漿，又依賴于宿主的細(xì)胞核，該病毒可以感染大多數(shù)昆蟲(chóng)，并對(duì)幼蟲(chóng)產(chǎn)生影響，因此蛙病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的蛙病毒染料法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)蛙病毒保守序列設(shè)計(jì)的專(zhuān)一性引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
規(guī)格及成分：
編號(hào) 成分 規(guī)格
試劑一 2×qPCR MagicMix 500 μL（棕色管）
試劑二 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液 1 mL（黃蓋）
試劑三 蛙病毒染料法PCR 引物混合液 100 μL（白蓋）
試劑四 蛙病毒染料法PCR 陽(yáng)性對(duì)
照(1×10E8 /μL) 50 μL（紅蓋）
試劑五 DNA 病毒裂解液（試用裝） 15 次（9 mL）
使用手冊(cè) 1 份
運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見(jiàn)使用方法）。
使用方法：
一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6 個(gè) 10倍稀釋度為例）：
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
8. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 上步制備的 PCR 陽(yáng)性對(duì)照的第 4號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝）或第 5 號(hào)（濃度為 1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 10 萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒 DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送 15 次一管式病毒 DNAout。
蛙病毒染料法熒光定量PCR試劑盒
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
10. 如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）：
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編號(hào) |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
2×qPCR MagicMix |
500 μL（棕色管） |
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試劑二 |
熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液 |
1 mL（黃蓋） |
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試劑三 |
蛙病毒染料法PCR 引物混合液 |
100 μL（白蓋） |
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試劑四 |
蛙病毒染料法PCR 陽(yáng)性對(duì) 照(1×10E8 /μL) |
50 μL（紅蓋） |
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試劑五 |
DNA 病毒裂解液（試用裝） |
15 次（9 mL） |
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使用手冊(cè) |
1 份 |
12.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
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成分 |
樣品管 N+2 個(gè) |
PCR 陰性 對(duì)照管 |
PCR陽(yáng)性對(duì)照管2-7 管 |
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2×qPCR MagicMix （棕色管） |
10μL |
10 μL |
各 10 μL |
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蛙病毒PCR引物混合液（白蓋） |
2 μL |
2 μL |
各2 μL |
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自備 10×ROX (見(jiàn)注) |
2 μL |
2 μL |
各 2 μL |
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N+2 待測(cè)樣品 DNA 模板 |
6 μL |
不加 |
不加 |
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第7步所得 PCR 陽(yáng)性對(duì)照稀釋液2-7 號(hào) |
不加 |
不加 |
各 6μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…） |
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)，吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的吸收光譜在 500 nm，發(fā)射光譜在 530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理：
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。